序言 ............................................................... 2 試驗前準備工作 ..................................................... 2 方法 ............................................................... 4 實施內(nèi)容 ........................................................... 4 結果 ............................................................... 5 結論 ............................................................... 6 附注 ............................................................... 6 參考資料 ........................................................... 6 初始污染菌檢測規(guī)范 ................................................. 7 確定滅菌劑量 ....................................................... 9 無菌檢查 .......................................................... 10
序言
本實驗是對醫(yī)用產(chǎn)品公司的一次性醫(yī)療用品進行了輻射滅菌劑量設定和驗證。實驗原理是基于ISO11137-2：2006的方法，即先對輻照前產(chǎn)品的初始污染菌進行測定，然后選擇驗證劑量。再用驗證劑量對產(chǎn)品進行輻照，并測定輻照后存活微生物的樣品件數(shù)，以此來確定所確定的驗證劑量能夠滿足10-6的滅菌保證水平。本實驗從 年 月 日開始** 年 月 日結束。
試驗前準備工作
一、樣品
1樣品：醫(yī)用產(chǎn)品，三個批號： 生產(chǎn)企業(yè)： 公司。 2器具及試劑 2.1器材 試管 容量瓶
三角燒瓶 酒精燈 滅菌剪刀、鑷子 滅菌平皿（9cm） 75％乙醇棉
滅菌刻度吸管(1ml、5ml)
紫外可見分光光度計 立式
壓力蒸汽滅菌器 電熱鼓風干燥箱 酸度計 恒溫培養(yǎng)箱 電熱恒溫水浴鍋 生化培養(yǎng)箱 電熱恒溫干燥箱
2.2培養(yǎng)基及試劑： a)流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 b)改良馬丁培養(yǎng)基 c)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
2.3稀釋液、沖洗液及其制備方法 a)質(zhì)量濃度為9g/L的無菌氯化鈉溶液
b)0.1％蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)pH值**7.1±0.2，分裝，滅菌。
c)pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。 二、實驗前準備 2.1培養(yǎng)基要求：
用于培養(yǎng)需（厭）氣菌和真菌的培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)基靈敏度檢查及其他各項要求應符合《中G藥典（二部）》附錄中《無菌檢查法》的規(guī)定。
培養(yǎng)基使用按中G藥典方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。制備后采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基保存在2～25℃、避光的環(huán)境。
2.2器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸氣
滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2h。
2.3無菌室要求：無菌室操作臺局部符合潔凈度100級單向流空氣區(qū)域要求。無菌室在消毒處理完畢后，檢查空氣中的菌落數(shù)，方法如下：取直徑約90mm培養(yǎng)皿數(shù)支，無菌操作注入融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL，在30℃～35℃培養(yǎng)48h證明無菌后，取3只培養(yǎng)皿在無菌室操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好，置30℃～35℃培養(yǎng)48h后取出檢查，3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個。
無菌試驗過程中檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在試驗開始進行時打開平皿蓋，**試驗結束蓋好照上法培養(yǎng)，符合上述要求。 2.4陽性對照：
選擇金黃色葡萄球菌為對照菌，接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物**營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時，將上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。陽性對照試驗的菌液制備方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應生長良好。 2.5陰性對照：
取相同稀釋液、沖洗液同上法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。方法
客戶提供生產(chǎn)的醫(yī)用產(chǎn)品，每件醫(yī)用產(chǎn)品均是一個獨立的單元產(chǎn)品，其樣品份額為1。具體步驟如下：
1. 隨機抽取連續(xù)三批常規(guī)生產(chǎn)的產(chǎn)品，每批10件，共30件做生物負載檢測。另從其中一批隨機取5件樣品，做回收率實驗。
2. 當每個批平均生物負載都不超過三批總平均生物負載的2倍時，根據(jù)三批的總平均負載的檢測結果，選擇滅菌保證水平為10-2的滅菌劑量作為驗證劑量。
3. 對以上三批抽樣產(chǎn)品連續(xù)生產(chǎn)的110件產(chǎn)品實施驗證劑量，實際吸收劑量應在驗證劑量的±3%之內(nèi)。
4. 對用驗證劑量輻照過的100件產(chǎn)品做無菌實驗，其余的10件產(chǎn)品做無菌試驗的驗證實驗。 5. 根據(jù)無菌實驗的結果，確定驗證劑量是否被接受，即確定的驗證劑量是否能夠滿足10-6的滅菌保證水平。
實施內(nèi)容
一、回收率測定
取5ml洗脫液洗脫5支產(chǎn)品，分別洗脫四次，然后將樣品用營養(yǎng)瓊脂做瓊脂覆蓋，于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48±2h，記錄結果并得出修正系數(shù)。 二、初始污染菌測定 #p#分頁標題#e#
將隨機抽取的30件樣品中生物負載進行評估，編號后，分別用5ml 洗脫液洗脫，吸取1ml置于9ml稀釋液中，振搖均勻后分別取1ml樣品液于兩個平皿中，記錄編號為101，102，代表五十倍樣，取1ml置于9ml稀釋液，振搖均勻后分別取1ml樣品液于兩個平皿中，記錄編號為1001，1002，代表五百倍樣。依次取第二件樣品，**30件樣品。傾注營養(yǎng)瓊脂，于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48±2h，記錄結果。 三、確定驗證劑量
ISO 11137：2006 醫(yī)療器械滅菌的有效性確認和常規(guī)控制的要求中規(guī)定，若批次平均生物負載的每一個生物負載數(shù)值< 總的平均生物負載*2，則用總的平均生物負載，若一批或更多批次的平均生物負載≥總的平均生物負載*2，則用**高批次。本次試驗采用總平均初始污染菌120（cfu/SIP）確定驗證劑量。查ISO11137：2006 表格得出對應的驗證劑量為8.2kGy，該試驗劑量下的無菌保證水平SAL為10-2。 四、驗證劑量輻照結果
從產(chǎn)品的單個批次中選出110個單元產(chǎn)品的樣本，暴露在XXXXX公司的電子加速器傳送帶上輻照，使輻射劑量落在8.2±5% kGy 范圍內(nèi)。輻照后進行無菌試驗。 五、無菌試驗 5.1供試液制備及接種
取樣品按容器內(nèi)表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1ml的比例，振搖數(shù)次。收集上述沖洗液或浸提介質(zhì)于無菌容器中。 5.2無菌檢驗培養(yǎng)溫度
硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。 改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。 5.3接種
采用直接接種法
每管培養(yǎng)基的**低用量——硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10 ml。 5.4培養(yǎng)、觀察
上述含培養(yǎng)基的容器分別置規(guī)定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，除陽性對照管和陰性對照管培養(yǎng)48～72小時外，其余管培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。
結果
對三批醫(yī)用產(chǎn)品進行初始污染菌測試后，修正系數(shù)為1.08，結果如下：
批 號 初始污染菌平均數(shù)（cfu/件）
總平均數(shù)因此，根據(jù)ISO11137-2：2006建立滅菌劑量的規(guī)定，選用總平均生物負載為120（cfu/件）來確定驗證劑量。
根據(jù)以上數(shù)據(jù)查表得驗證劑量為 kGy,對以上 批次110件，實測劑量為 kGy（見輻照證明書）。經(jīng)觀察，100件樣品經(jīng)驗證劑量輻照后的無菌檢查陽性數(shù)為零。
結論
依據(jù)ISO 11137 ：2006 規(guī)定，當SAL=10-6時，醫(yī)用產(chǎn)品的滅菌劑量為 kGy。在隨后的常規(guī)輻照滅菌過程中，應通過劑量計監(jiān)測，證明每一個產(chǎn)品的**小吸收劑量能夠達到 kGy 的滅菌劑量，使滅菌保證水平為10-6SAL。依據(jù)ISO 11137 ：2006 標準，為了確保作為10-6SAL的滅菌劑量持續(xù)有效，必須按照規(guī)定的周期進行驗證劑量審核，通常每三個月進行一次。附注
1、 試驗樣品不可替代批量產(chǎn)品。
2、
當批量產(chǎn)品輻照時的劑量確定，必須隨機抽取該批量部分產(chǎn)品作初始污染菌驗證。
