1  適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽流感的血凝試驗、血凝抑制試驗。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽流感抗體的檢測（主要適用于血清樣品）。
 

2  血凝試驗

2.1  材料與試劑

2.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通離心機(jī)、微型振蕩器、注射器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液器及96孔V形血凝反應(yīng)板。

2.2.2  pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，配制方法參見附錄A。

2.2.3  1%雞紅細(xì)胞懸液，配制方法參見附錄B。

2.2.4  阿氏液，配制方法參見附錄C。

2.2.5  標(biāo)準(zhǔn)禽流感病毒抗原，購入的標(biāo)準(zhǔn)禽流感病毒應(yīng)檢測其血凝效價并進(jìn)行無菌檢驗，以檢查與所標(biāo)HA效價是否相符。若不符，應(yīng)重復(fù)檢測并到相關(guān)實(shí)驗室驗證。
 

2.2  操作程序

A. 取96孔V形微量反應(yīng)板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再補(bǔ)加25 μL PBS。

B. 吸取25 μL標(biāo)準(zhǔn)禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混勻。

C. 從第1列孔吸取25 μL混勻后的抗原液加到第2列孔中，混勻后吸取25μL加入到第3列孔中，依次進(jìn)行系列倍比稀釋**第11列孔，**后從第11列孔各吸取25 μL棄之，設(shè)第12列孔為紅細(xì)胞對照。

D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液。

E. 將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩1 min，室溫（20-25℃）靜置45 min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過高，可于4℃靜置60 min，紅細(xì)胞對照孔成明顯的紐扣狀沉到孔底時即可判定結(jié)果。
 

2.3  結(jié)果判定

A. 在紅細(xì)胞對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，將反應(yīng)板作45°傾斜，觀察紅細(xì)胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒**大稀釋度為該抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的**高稀釋倍數(shù)為1個血凝單位（HAU）。

B. **終結(jié)果取2倍、3倍倍比稀釋抗原的血凝滴度的幾何平均值。
 

3  血凝抑制試驗

3.1  材料與試劑

3.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通離心機(jī)、微型振蕩器、煮沸消毒器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液器及96孔V形血凝反應(yīng)板。

3.1.2  pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)配制方法參見附錄A。

3.1.3  1%雞紅細(xì)胞懸液配制方法參見附錄B。

3.1.4  阿氏液，配制方法參見附錄C。

3.1.5  4單位抗原，制備方法參見附錄D。

3.1.6  HA效價高于10log2時可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)。
 

3.2  操作程序

A. 根據(jù)血凝試驗結(jié)果配制4單位抗原。以能引起100%血凝的病毒**高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位，4單位抗原的的配制方法如下：假設(shè)抗原的血凝滴度為1:256（28），則4單位抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4），稀釋時，將1 mL抗原加入到63 mL PBS中即為4單位抗原。但是該4單位抗原必須經(jīng)過驗證（如附錄D  4單位抗原的標(biāo)定）后才可確定其稀釋倍數(shù)，用于血凝抑制效價的測定。

B. 取96孔V形微量反應(yīng)板，用移液器在第1~11孔各加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。

C. 在第1孔加入25 μL被檢血清，充分混勻后移出25 μL加**第2孔，依次類推，倍比稀釋**第10孔，第10孔棄去25 μL，設(shè)第11孔為病毒對照，第12孔為紅細(xì)胞對照。

D. 在第1~11孔各加入25 μL 4單位抗原，輕叩反應(yīng)板，使反應(yīng)物混合均勻，室溫20-25℃下靜置30 min。

E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液。

F. 將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩1 min，室溫（20-25℃）靜置40 min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過高，可于4℃靜置60 min，紅細(xì)胞對照孔成明顯的紐扣狀沉到孔底時即可判定結(jié)果。
 

3.3  結(jié)果判定

A. 在紅細(xì)胞對照出現(xiàn)完全沉淀、病毒對照出現(xiàn)完全凝集的情況下，將反應(yīng)板作45°傾斜，從反應(yīng)板背側(cè)觀察。以完全抑制紅細(xì)胞凝集的**大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。

B. 當(dāng)被檢血清對其HI效價大于等于4log2，判為禽流感抗體陽性。
 

附錄A

pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)配制

氯化鈉（NaCl）

氯化鉀（KCl）

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

磷酸二氫鉀（KH2PO4）

加蒸餾水**

將上述成分依次溶解，用鹽酸（HCl）調(diào)pH**7.2，分裝，121℃、15 min高壓滅菌，一經(jīng)使用，于4℃保存不超過3周。
 

附錄B

1%雞紅細(xì)胞懸液配制

采集**少3只2~6月齡SPF公雞或無禽流感和禽流感抗體的非免疫雞的抗凝血液與等量檸檬酸鈉溶液混合，放入離心管中，加入3~4倍體積的PBS混勻，以1500 r/min離心5~10 min，去掉血漿和白細(xì)胞層，反復(fù)洗滌三次，**后吸取壓積紅細(xì)胞用PBS配制成體積分?jǐn)?shù)為1%的懸液，于4℃保存?zhèn)溆谩?br />  

附錄C

阿氏液的配制

葡萄糖（C6H12O6．H2O)

檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7.2H2O)

檸檬酸（C6H8O7.H2O）

氯化鈉（NaCl)

加蒸餾水**100 ml，溶解，過濾，分裝，121℃、30 min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br />  

附錄D

4單位抗原的制備

根據(jù)血凝試驗測定的血凝效價，判定4個血凝單位的稀釋倍數(shù)，并作復(fù)歸試驗。例如：病毒2倍倍比稀釋時的HA效價為9log2，3倍時的HA效價為8log2，其4個血凝單位為6log2~7log2，則將病毒在96~128倍稀釋。則可以假定90×，100×，110×，120×，130×為4HAU，分別再作2×、3×、4×、5×、6×稀釋，每個4個孔，并作紅細(xì)胞和病毒對照，依此做一次血凝實(shí)驗，從而確定4單位抗原。判定時4×的半數(shù)100%凝集則為4單位抗原，1個100%凝集說明稀釋倍數(shù)偏大，3個100%凝集稀釋倍數(shù)偏小。